神経細胞のアクチン細胞骨格を担う因子を発見

早稲田大学人間科学学術院の榊原 伸一（さかきばら しんいち）教授、山田 晴也（やまだ せいや）助教らの研究グループは、新規同定したInka2が脳の神経細胞のアクチン細胞骨格（アクチンフィラメント）の制御を介してシナプス（樹状突起スパイン）形成を調節する機構を明らかにしました。神経細胞の成熟と共に樹状突起上に形成されるスパインは、神経細胞同士が情報を適切にやり取りするシナプスの形成に必須です。Pakファミリーによるアクチンフィラメントのダイナミックな重合・脱重合は、スパインの適切な個数や形態を管理しています。我々が生きる上で重要な生命現象であるこの制御機構の破綻は、統合失調症や自閉スペクトラム症、アルツハイマー病など様々な精神疾患や発達障害に関与します。しかし、その制御機構には未解明な点が多くありました。本研究グループは、Inka2とアクチンフィラメントの重合因子Pak4に着目し、Inka2が脳内の神経細胞特異的にPak4の酵素活性を阻害し、アクチンフィラメントの重合を抑制することを発見しました。そして、Inka2が脳内で欠損するとPak4-LIMK-Cofilinシグナル経路が亢進し、スパイン形成の異常を引き起こすことを明らかにしました。本研究で明らかにされたInka2によるスパイン形成機構が、様々な疾患発症原因の解明に寄与できると期待されます。
本研究成果は、米国のオープンアクセスジャーナル『PLOS Genetics』のオンライン版に2022年10月28日（火）AM 3:00（日本時間）に掲載されました。　
 
■これまでの研究で分かっていたこと（科学史的・歴史的な背景など）
アクチン細胞骨格の重合・脱重合のバランスは、神経細胞の樹状突起スパインの形成・安定性に重要な役割を果たします。アクチンフィラメントを重合する制御機構として、セリン・スレオニンキナーゼであるPakファミリー（Pak1-3のグループIとPak4–6のグループII）及びその下流シグナル因子であるLIMK、Cofilinが知られています。Pakファミリーの適切な制御は、異常なスパイン形成を防ぎ、健全な脳の発達を促進する上で非常に重要ですが、そのような内在性Pakの阻害因子は神経細胞では未だ見つかっていませんでした。一方、本研究グループがマウス脳内から新規同定したInka2遺伝子は、大脳皮質や海馬の神経細胞に豊富に存在します。また、Inka2タンパク質と相同性の高いInka1タンパク質は共にinka Box(iBox) 領域を持ち、iBoxとPak4が相互作用することが示唆されていました。しかしながら、Inka2の脳内における役割及びPak4との関係性は明らかになっていませんでした。
 
■今回の研究で新たに実現しようとしたこと、明らかになったこと
本研究ではまず、「Inka2タンパク質のiBoxが、Pakファミリーのリン酸化能をブロックすることでアクチンフィラメントの重合を阻害する」という仮説を検証しました。培養細胞にInka2の過剰発現またはPak4の発現抑制を行うと、細胞内のアクチンフィラメントが脱重合し、細胞の輪郭が球形になりました。Inka2がアクチンフィラメント及びPak4と共局在しアクチン骨格形成に関与することから、Inka2のiBox領域がPak4と相互作用することを、Inka2のiBox欠失体（Inka2-ΔiBox）を用いて検証しました。免疫沈降実験からInka2-iBox依存的にPak4と相互作用することが明らかになりました。また、Inka2-ΔiBoxの過剰発現でアクチンフィラメントの脱重合は起こりませんでした。Inka2のiBox領域が直接的にPak4のリン酸化能を阻害するのかを検証するため、大腸菌由来の精製タンパク質を用いた、無細胞系のin vitroリン酸化アッセイを行いました。Pak4、Inka2-iBox、Inka1-iBox、そしてPak4のリン酸化に必要な基質を反応させると、Inka1-iBoxとInka2-iBoxで共に、濃度依存的にPak4の酵素活性を強く抑制することが明らかになりました。その一方で、グループIのPakファミリーへの抑制効果は見られませんでした。以上より、Inka1とInka2が持つiBoxは、グループIIのPakファミリー（特にPak4）のリン酸化能を直接的に阻害することでアクチンフィラメントの脱重合に関与することが明らかになりました。
最後にInka2の欠損がPak4シグナルに影響を与えるかを大脳皮質の神経細胞のシナプスから単離したシナプトニューロソーム(SN)を用いて検証しました。Inka2-/-群のSNではPak4の下流シグナルでアクチンフィラメントの重合を制御する経路であるLIMK、Cofilinのリン酸化が亢進することが明らかになりました。即ち、Inka2の欠損により、Pak4の酵素活性が過剰亢進し、その結果としてPak4-LIMK-Cofilinシグナルのリン酸化も亢進することで、スパイン形成の異常が起きることが明らかになりました。
 
■研究の波及効果や社会的影響
Pakファミリーによるスパイン形成制御は、統合失調症や自閉スペクトラム症、アルツハイマー病など様々な精神疾患や発達障害に関与します。また、Pakファミリーは神経系以外においてもがんを始めとした様々な疾患に関与することが分かってきています。本研究でInka2が、脳内における初めてのPak4阻害因子であることが明らかになりました。今後Inka2が関与する疾患発症の原因解明やInka2によるPak４阻害をターゲットとする創薬開発へつながることが期待されます。
 
■研究者のコメント
本研究は早稲田大学の研究グループ（山田 晴也助教, 水越 智也氏）と福井大学の徳永 暁憲准教授、皆様の協力により論文化できました。細胞内のアクチン細胞骨格は、神経細胞のスパイン形成をコントロールすることで多数の精神疾患にも関与する重要な生命現象です。本研究は、神経細胞のアクチン細胞骨格の新たな調節機構を発見したこと、また脳内でPak4活性を阻害する働きを持つ新たな因子を発見したことから、今後は基礎研究のみならず、臨床的な観点からも社会的な意義は大きいと考えています。
 
■論文情報
雑誌名：PLOS Genetics
論文名：Inka2, a novel Pak4 inhibitor, regulates actin dynamics in neuronal development
執筆者名（所属機関名）： 山田 晴也1, 水越 智也1, 徳永 暁憲2, 榊原 伸一1*
1）早稲田大学 人間科学学術院 分子神経科学研究室
2）福井大学 ライフサイエンス支援センター生物資源部門
*）責任著者
掲載日時（現地時間）：10月27日（木）11:00（太平洋時間）/14:00（米東部時間）
掲載日時（日本時間）：10月28日（金）3:00
掲載URL：https://journals.plos.org/plosgenetics/article?id=10.1371/journal.pgen.1010438
DOI：https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1010438